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Marcadores genéticos: ¿Para qué sirven?
Los marcadores moleculares son un grupo de marcadores genéticos que, aplicados a la diferenciación de genotipos, representan un arma muy poderosa para la protección de los derechos de los mejoradores y productores. Biotecnología aplicada.

 

Se denominan marcadores genéticos a  aquellas señales, sean del tipo que sean, que sirven para indicarnos la presencia cercana de un gen de interés en un cromosoma dado. La señal a la que se hace referencia puede ser un rasgo determinado (fenotipo) o bioquímico, y debe ser fácilmente identificable para facilitar la localización de uno o más genes. Pueden indicarnos, por ejemplo, la resistencia a una determinada enfermedad (estrés biótico), tolerancia a salinidad (estrés abiótico), sin necesidad de que las mencionadas situaciones se hayan presentado; en otras palabras, si este organismo tiene tal señal, presentará tal resistencia o tolerancia.

¿Cómo se los aplica?
Cuando se observa que dos señales aparecen siempre juntas en un individuo (por ejemplo: hojas lobuladas y pétalos disciplinados), y esas características se repiten a través de las generaciones, se dice que ambos rasgos (o señales) están asociados y, por lo tanto, se infiere que se encuentran próximos en el cromosoma. Caso contrario, si hay dos rasgos que se relacionan con muy baja frecuencia a través de las generaciones se dice que o están muy lejos en el cromosoma, o bien en cromosomas diferentes.

¿Para qué sirven?
El conocimiento de estas asociaciones de señales sirve para predecir las cualidades de un organismo; es decir, la aparición de una de ellas me indicará la presencia de la otra y, con esto, se aceleran los tiempos del proceso de mejoramiento.

Los marcadores genéticos pueden ser: morfológicos, bioquímicos y moleculares, cada uno con sus ventajas y desventajas.
Los más evidentes son los marcadores morfológicos:coloración, tamaño, rasgos, diferencias en el crecimiento y en el comportamiento, etc.
El marcador bioquímico más utilizado es el denominado análisis de isoenzimas. Esta técnica se basa en la separación de enzimas con la misma función, pero diferenciadas en tamaño, carga o conformación. Es una técnica muy utilizada por su sencillez y economía de manejo, pero tiene la limitación de poseer una baja sensibilidad.
Por otro lado, se definen como marcadores moleculares  las señales que se pueden generar de un organismo tomando como base el ADN.

Los marcadores moleculares, como herramienta para la caracterización y diferenciación entre genotipos, fueron rápidamente utilizados por genetistas y mejoradores de plantas.

Como herramientas para la detección de variabilidad genética y para la identificación de materiales, presentan una serie de ventajas respecto de otros marcadores (como por ejemplo, los proteicos): su neutralidad en relación con el proceso de selección, su poder de resolución, tienen una alta sensibilidad y generan una gran cantidad de señales que permiten, con celeridad y altísimo grado de certeza, discriminar en forma inequívoca entre individuos muy relacionadas genéticamente (por ejemplo, semillas pertenecientes a una misma vaina). Por lo tanto, son la herramienta de aplicación para la generación de las huellas digitales genéticas (en inglés, fingerprint), en los estudios de parentesco (el famoso ADN por la paternidad dudosa).

Ofrecen otras ventajas:
-Se pueden detectar pequeñas variaciones con mínimas cantidades de material.
-No son afectados por el fenotipo, son totalmente neutros.
-Pueden detectarse en cualquier época del año y cualquier estado de desarrollo (incluso, embrionario).
-Se distribuyen a lo largo de todo al ADN del individuo, lo que facilita la ubicación de los genes y permite construir los mapas genéticos.
-Dependiendo de la técnica que se aplique, muchos de estos marcadores son codominantes (revelan ambos alelos).
-El número de variaciones (polimorfismo) que pueden generar es enorme.

Existen diferentes tipos de técnicas usadas para generar marcadores moleculares a partir de ADN; en nuestro laboratorio de Biología Molecular del Instituto de Floricultura del INTA-Castelar, hemos puesto a punto una técnica que se denomina microsatélites anclados, y se basa en multiplicar (incrementen su cantidad respecto del resto de la molécula de ADN; a este proceso los biólogos moleculares lo llaman amplificación), por medio de una enzima (la Taq polimerasa) y otros reactivos específicos, ciertas regiones del ADN. Que esas regiones de ADN se multipliquen, o no, depende de cada individuo, y eso le da la especificidad que caracteriza a los marcadores que se basan en este principio.

Para el desarrollo de técnica, el protocolo comienza aislando y purificando el ADN a partir del tejido elegido (comúnmente hojas), al igual que con las proteínas se utilizan soluciones de extracción adecuadas para tratar que el ADN se degrade lo menos posible.




Figura 1. Muestra el ADN purificado de diferentes individuos, tal como se los visualiza en la matriz de agar, teñido con un producto que fluorece a luz ultravioleta. Las flechas indican los marcadores de peso molecular y, como es ADN de concentración conocida, sirve como referencia para la cuantificación. El resto es ADN extraído y purificado de 14 individuos de N. linariaefolia. El ADN es de relativa buena calidad, en todos los casos se detecta una banda de alto peso molecular y la mayoría está poco degradado. Es ADN apto para ser utilizado.

Una vez purificado, verificada su integridad y cuantificado (esto también se hace en una matriz de gelatina (agar) (ver Figura 1), se toma una muy pequeña cantidad, 30 nanogramos (esto es la mil millonésima parte de 1 gr), se mezcla con los reactivos específicos que se denominan cebadores y que no son otra cosa que pedacitos muy chiquitos de ADN, que de acuerdo con la secuencia que tengan se pegarán (o no) en diferentes regiones del ADN, y eso generará diferentes patrones de bandas (las tantas veces mencionadas señales) que darán el perfil de cada individuo como puede apreciarse en la Figura 2.



Figura 2. Productos de amplificación obtenidos de los 4 clones de N. linariaefolia con diferentes cebadores que definen los perfiles de identificación molecular de cada uno de los clones. Calles 1-15-25: Marcador de peso molecular 1. Calles 2-5: Cebador 1. Calles 6-9: Cebador 2. Calles 10-13: Cebador 3. Calles 16-19: Cebador 4. Calles 21-24: Cebador 5  y Calles: 26-29: Cebador 6. Calles: 2-6-10-16-21-26: Clon 1. Calles: 3-7-11-17-22-27: Clon 2. Calles: 4-8-12-18-23-28: Clon 3. Calles: 5-9-13-19-24-29: Clon 4 y Calles 14-20-30: Marcador de peso molecular 2.

¿Cómo se procesan estos geles? Cada altura del gel donde aparece una banda está definida por el peso molecular que indica el marcador de referencia en el mismo gel. Para llevar a cabo el análisis, se aplica el sistema binario, presencia (1) y ausencia (0) de banda, y con estos datos, se construye la matriz correspondiente (Figura 3), que, eventualmente puede transformarse en un sistema de barras, y cada clon queda inequívocamente identificado.

En cultivos ornamentales, se han probado diferentes tipos de técnicas basadas en el principio de amplificación diferencial por Taq polimerasa (existen muchas y muy variadas siglas que denominan a estas diferentes técnicas).

Estos marcadores moleculares aplicados a la diferenciación de genotipos son un arma muy poderosa para la protección de los derechos de los mejoradores y productores. Para detectar la propagación fraudulenta de un cultivar, el método tradicional se basa en el análisis y la comparación de los caracteres fenotípicos de plantas crecidas y en período de floración.

Esto se soluciona utilizando marcadores moleculares que, de manera más rápida y precisa, permiten darle trazabilidad a la comercialización de un producto, evaluar su identidad y la estabilidad genética de una colección en un banco de germoplasma.

A manera de ejemplo práctico, si existiesen dudas con el origen de un material determinado, el procedimiento sería tomar muestras del mismo, procesarlo para revelar algún tipo de marcador molecular y compararlo con el material que se supone de origen, junto con otras características, definidas en el descriptor del material original. Si la coincidencia es irrefutable, quedaría en evidencia que la persona poseedora del material bajo sospecha está cometiendo un ilícito; situación que la dejaría expuesta a posibles acciones legales.

Como el resto de las técnicas biotecnológicas, la de marcadores moleculares está siendo intensamente aplicada en especies ornamentales, sobre todo por la relevancia que éstos están adquiriendo en la verificación de los criterios de distinguibilidad, estabilidad y uniformidad de las nuevas variedades que, año a año, ingresan al mercado.

Figura 3. Matriz de identificación molecular para los clones “N1”, “N2”, “N3” y “N4”, obtenida de los geles de la Figura 2. (1) Presencia de banda, (0) ausencia de banda.


Texto: Dr. Alejandro Escandón y Bioq. Mariana Pérez de la Torre (IF - INTA)
Foto: Florencia Cesio

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